Hemoglobin elektroforézis kísérlet

Kísérlet elve

A hemoglobin elektroforézis célja a különböző normál és kóros hemoglobinok kimutatása és megerősítése.

A különböző hemoglobintípusok eltérő töltései és izoelektromos pontjai miatt egy bizonyos pH-jú pufferoldatban, amikor a hemoglobin izoelektromos pontja alacsonyabb, mint a pufferoldat pH-ja, a hemoglobin negatív töltést hordoz, és az elektroforézis során az anód felé vándorol. Ezzel szemben a pozitív töltésű hemoglobin a katód felé mozog.

Bizonyos feszültség alatt és meghatározott elektroforézisidő után a különböző töltésű és molekulatömegű hemoglobinok eltérő migrációs irányt és sebességet mutatnak. Ez lehetővé teszi a különálló zónák elkülönítését, és ezt követően kolorimetriás vagy elektroforetikus pásztázó analízis végezhető ezeken a zónákon a különböző hemoglobinok mennyiségi meghatározására. A leggyakrabban alkalmazott módszer a pH 8,6 cellulóz-acetát membrán elektroforézis.

A citoplazmán belül a glikogénben vagy poliszacharid anyagokban (például mukopoliszacharidok, mukoproteinek, glikoproteinek, glikolipidek stb.) jelenlévő etilénglikol-csoportok (CHOH-CHOH) perjodsav hatására oxidálódnak és aldehidcsoportokká alakulnak (CHO-CHO). Ezek az aldehidcsoportok a színtelen, lilás-piros Schiff-reagenssel egyesülve lilásvörös festéket képeznek, amely lerakódik ott, ahol a sejtben poliszacharidok vannak jelen. Ezt a reakciót periodikus sav-Schiff (PAS) festésnek nevezik, korábban glikogénfestésnek nevezték.

Kísérleti módszer

Anyagok:Cellulóz-acetátmembrán, elektroforézis készülék(DYCP-38C és tápegység DYY-6C), Kiváló mintabetöltő eszköz(pipetta), spektrofotométer, kolorimetriás küvetták, pufferek.

Puffer:

(1) pH 8,6 TEB puffer: Mérjünk ki 10,29 g Triszt, 0,6 g EDTA-t, 3,2 g bórsavat, és adjunk hozzá desztillált vizet 1000 ml-hez.

(2) Borát puffer: Mérjünk le 6,87 g bóraxot és 5,56 g bórsavat, és adjunk hozzá desztillált vizet 1000 ml-re.

Eljárás:

PHemoglobin oldat javítása

Vegyünk 3 ml vért, amely véralvadásgátlóként heparint vagy nátrium-citrátot tartalmaz. Centrifugálja 2000 fordulat/perc sebességgel 10 percig, és dobja ki a plazmát. Mossa meg a vörösvértesteket háromszor fiziológiás sóoldattal (750 fordulat/perc, minden alkalommal 5 perces centrifugálás). Centrifugálja 2200 fordulat/perc sebességgel 10 percig, és öntse ki a felülúszót. Adjunk hozzá azonos mennyiségű desztillált vizet, majd adjunk hozzá térfogatának 0,5-szeresét. Erősen rázza 5 percig, majd centrifugálja 2200 rpm-en 10 percig, hogy a felső Hb-oldatot összegyűjtse későbbi felhasználásra.

A membrán áztatása

Vágja a cellulóz-acetát membránt 3 cm × 8 cm méretű csíkokra. Áztassuk be őket pH 8,6-os TEB pufferbe, amíg teljesen telítődnek, majd távolítsuk el, és szűrőpapírral töröljük szárazra.

Foltozás

Pipettával vigyen fel 10 μl hemoglobin oldatot függőlegesen a cellulóz-acetát membránra (a durva oldalra), körülbelül 1,5 cm-re a szélétől.

Elektroforézis

Öntse a borát pufferoldatot az elektroforézis kamrába. Helyezze a cellulóz-acetát membránt foltos oldalával a kamra katódvégére. Működtesse 30 percig 200 V-on.

Elúció

Vágja ki a HbA és HbA2 zónákat, helyezze külön kémcsövekbe, és adjon hozzá 15 ml, illetve 3 ml desztillált vizet. Finoman rázza fel, hogy a hemoglobin teljesen eluáljon, majd keverje össze.

Kolorimetria

Az elúciós oldathoz desztillált vízzel nullázzuk le az abszorbanciát, és mérjük meg az abszorbanciát 415 nm-en.

Számítás

HbA2(%) = HbA2 cső abszorbanciája / (HbA cső abszorbanciája × 5 + HbA2 cső abszorbanciája) × 100%

Kísérleti eredmények számítása

Referencia tartomány pH 8,6 TEB puffer cellulóz-acetát elektroforézishez: HbA > 95%, HbA2 1%-3,1%

Megjegyzések

Az elektroforézis ideje nem lehet túl hosszú. A cellulóz-acetát membránnak nem szabad kiszáradnia az elektroforézis során. Állítsa le az elektroforézist, ha a HbA és a HbA2 egyértelműen elválik egymástól. A hosszan tartó elektroforézis sáv diffúziót és elmosódást okozhat.

Kerülje a túl sok minta használatát. A túlzott mennyiségű hemoglobin sávleváláshoz vagy elégtelen festődéshez vezethet, ami tévesen megemelkedett HbA-szintet eredményezhet.

Kerülje el a cellulóz-acetát membrán fehérjékkel való szennyeződését.

Az áramerősség nem lehet túl nagy; ellenkező esetben előfordulhat, hogy a hemoglobin sávok nem válnak el egymástól.

Kontrollként mindig vegyen be normál egyénektől származó mintákat és a szükséges ismert rendellenes hemoglobint.

A Beijing Liuyi Biotechnology gyártja a professzionális elektroforézis tartályt a hemoglobin elektroforézishez, amely a modellDYCP-38Ccellulóz-acetát membrán elektroforézis tartály, és a cellulóz-acetát membrán elektroforézis tartályhoz kétféle elektroforézis tápegység áll rendelkezésreDYY-2CésDYY-6Ctápegység.

Eközben a Beijing Liuyi Biotechnology cellulóz-acetát membránt biztosít az ügyfelek számára, és a cellulóz-acetát membrán mérete testreszabható. Üdvözöljük, kérjen tőlünk mintákat és további információkat.

A Beijing Liuyi márka több mint 50 éves múltra tekint vissza Kínában, és a vállalat stabil és kiváló minőségű termékeket tud nyújtani a világ minden tájáról. Évek óta tartó fejlesztés során érdemes választani!

Most partnereket keresünk, mind az OEM elektroforézis tartályt, mind a forgalmazókat szeretettel várjuk.

Ha bármilyen vásárlási terve van termékeinkkel kapcsolatban, kérjük, ne habozzon kapcsolatba lépni velünk. Üzenetet küldhet nekünk e-mailben[e-mail védett]vagy[e-mail védett], vagy hívjon minket a +86 15810650221 számon, vagy adja hozzá a Whatsapp +86 15810650221 számot, vagy a Wechat: 15810650221